Projeto

Introdução, justificativa, objetivos e metodologia

Introdução e justificativa

Contexto: RAM e K. pneumoniae em UTIs

A resistência antimicrobiana (RAM) é reconhecida como uma das principais ameaças globais à saúde, associada a aumento de mortalidade, prolongamento de internações e elevação de custos assistenciais. Entre os patógenos de maior relevância em ambientes hospitalares, Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenêmicos ocupa posição prioritária por combinar:

Elevada capacidade de aquisição de determinantes de resistência
Disseminação clonal em múltiplas unidades
Persistência prolongada em ambiente hospitalar

No Brasil, dados da ANVISA apontam elevada frequência de resistência a carbapenêmicos em isolados de K. pneumoniae associados a infecções graves em UTIs, com predomínio dos clones de alto risco ST11, ST16 e ST258/CC258.

Base multicêntrica consolidada

O projeto parte de um conjunto abrangente de dados gerados em estudo multicêntrico longitudinal (Processo CNPq 408811/2022-6), com amostragem em três fases padronizadas:

Fases do estudo multicêntrico
Fase	Descrição	Período
T0	Pré-intervenção	Abril–Setembro 2023
T1	Intervenção	—
T2	Pós-intervenção	—

No total, foram recuperados 406 isolados de K. pneumoniae em 6 UTIs da Região Metropolitana de São Paulo:

Distribuição dos isolados por origem
Origem	n
Swabs de vigilância	300
Sítios infecciosos	79
Ambiental (superfícies)	27
Total	406

Dos isolados clínicos, 144 não suscetíveis a carbapenêmicos (CIM de meropenem ≥ 2 µg/mL) foram sequenciados em plataforma Illumina NextSeq 550 (2×150 bp; cobertura >100×), com dados depositados em repositórios públicos (BioProject PRJNA1185159; SRA SRP545647).

Lacuna de conhecimento

Lacuna remanescente

Os 27 isolados ambientais de K. pneumoniae coletados de superfícies de alto toque ainda não foram sequenciados. A ausência de dados genômicos ambientais impede:

Quantificar a proximidade filogenômica entre isolados de pacientes e do ambiente (resolução em nível de SNP)
Avaliar compartilhamento de plasmídeos e elementos móveis entre compartimentos
Identificar determinantes genômicos associados à adaptação sob protocolos de desinfecção química

Hipótese central

O ambiente de UTI, submetido continuamente a protocolos de desinfecção química (compostos quaternários de amônio/biguanidas), pode selecionar e/ou manter subpopulações com maior aptidão ambiental, mediada por:

Genes de tolerância a biocidas (qac, smr, emr)
Sistemas de efluxo
Mecanismos de resposta a estresse
Fatores associados à formação de biofilme

Objetivos

Objetivo geral

Integrar genômica clínica e ambiental para investigar determinantes associados à persistência e transmissão de clones de alto risco de K. pneumoniae em UTIs brasileiras sob protocolos de desinfecção química de rotina, produzindo evidências para aprimorar vigilância e controle de infecção no SUS.

Objetivos específicos

Sequenciar e montar os genomas dos 27 isolados ambientais de K. pneumoniae, aplicando controle de qualidade, montagem e anotação padronizados, com depósito em repositório público.
Reconstruir o relacionamento filogenômico entre isolados clínicos (n=144) e ambientais (n=27) por análise em nível de SNP (core genome), identificando clusters compatíveis com transmissão e persistência.
Comparar resistoma, viruloma e mobiloma entre compartimentos clínico e ambiental, com ênfase em determinantes de resistência a carbapenêmicos e genes de tolerância a desinfetantes.
Investigar determinantes de persistência por GWAS bacteriano e modelos estatísticos controlando estrutura populacional.
Gerar evidências aplicáveis à prática de controle de infecção para CCIHs e vigilância em UTIs.

Metodologia

Delineamento

Estudo observacional analítico baseado em coorte multicêntrica longitudinal com amostragem em três fases (T0/T1/T2) em seis UTIs. O doutorado utilizará:

Conjunto clínico: 144 genomas já sequenciados e curados
Conjunto ambiental: 27 isolados a serem sequenciados

Sequenciamento dos isolados ambientais

Pipeline de sequenciamento e montagem
Etapa	Método/Ferramenta
Extração de DNA	DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN)
Preparo de bibliotecas	Nextera XT DNA Library Prep (Illumina)
Sequenciamento	Illumina NextSeq 550, 2×150 bp, >100×
QC de leituras	FastQC / MultiQC
Trimagem	Trimmomatic
Montagem de novo	SPAdes
Avaliação de qualidade	QUAST, CheckM

Análises bioinformáticas

Ferramentas para análises comparativas
Análise	Ferramentas
Anotação	Prokka
MLST / cgMLST	Pasteur scheme
Sorotipagem capsular	Kaptive (K e O loci)
Filogenômica (SNP)	Snippy → IQ-TREE
Resistoma	AMRFinderPlus, ResFinder, CARD/RGI
Viruloma	VFDB
Tolerância a biocidas	BacMet + busca dirigida (qac, smr, emr, sugE)
Plasmidoma	PlasmidFinder, MOB-suite
Integrons	IntegronFinder, ISfinder
GWAS bacteriano	pyseer (modelo de efeitos mistos)

Ensaios fenotípicos complementares

Em subconjunto racional de isolados:

CIM para desinfetantes: microdiluição em caldo com cloreto de benzalcônio (0,5–512 µg/mL)
Biofilme: cristal violeta em microplacas de 96 poços (triplicata, 3 repetições; absorbância 570 nm)
Estresse oxidativo: sobrevivência com H₂O₂ 10 mM por 30 min, contagem UFC/mL

Alinhamento estratégico

O projeto está alinhado ao Instituto Paulista de Resistência aos Antimicrobianos (ARIES-UNIFESP), CEPID-FAPESP (Processo 2021/10599-3). A caracterização de clones prioritários poderá subsidiar frentes complementares de inovação em controle de infecção, incluindo abordagens de biocontrole baseadas em bacteriófagos.

Estágio BEPE — McMaster University

Estágio de 12 meses no exterior

Supervisor: Prof. Dr. Andrew G. McArthur — diretor do McMaster Infectious Disease Interdepartmental Group e líder do CARD (Comprehensive Antibiotic Resistance Database).

Cronograma de atividades do estágio BEPE
Período	Atividades	Entregas
Meses 1–3	Integração; treinamento CARD/RGI; curadoria de genes de resistência a desinfetantes	Relatório de curadoria
Meses 4–6	Sequenciamento long-read (~20 isolados); montagem híbrida	Genomas completos; mapa de integrons
Meses 7–9	Análises comparativas internacionais; GWAS expandido	Painel preditivo preliminar
Meses 10–12	Validação; submissão de dados ao CARD; manuscritos	Manuscrito submetido

--- title: "Projeto" subtitle: "Introdução, justificativa, objetivos e metodologia" --- ## Introdução e justificativa ### Contexto: RAM e *K. pneumoniae* em UTIs A resistência antimicrobiana (RAM) é reconhecida como uma das principais ameaças globais à saúde, associada a aumento de mortalidade, prolongamento de internações e elevação de custos assistenciais. Entre os patógenos de maior relevância em ambientes hospitalares, *Klebsiella pneumoniae* resistente a carbapenêmicos ocupa posição prioritária por combinar: - Elevada capacidade de aquisição de determinantes de resistência - Disseminação clonal em múltiplas unidades - Persistência prolongada em ambiente hospitalar No Brasil, dados da ANVISA apontam elevada frequência de resistência a carbapenêmicos em isolados de *K. pneumoniae* associados a infecções graves em UTIs, com predomínio dos clones de alto risco **ST11**, **ST16** e **ST258/CC258**. ### Base multicêntrica consolidada O projeto parte de um conjunto abrangente de dados gerados em estudo multicêntrico longitudinal (**Processo CNPq 408811/2022-6**), com amostragem em três fases padronizadas: | Fase | Descrição | Período | |------|-----------|---------| | **T0** | Pré-intervenção | Abril–Setembro 2023 | | **T1** | Intervenção | — | | **T2** | Pós-intervenção | — | : Fases do estudo multicêntrico {.striped} No total, foram recuperados **406 isolados** de *K. pneumoniae* em 6 UTIs da Região Metropolitana de São Paulo: | Origem | n | |--------|---| | Swabs de vigilância | 300 | | Sítios infecciosos | 79 | | Ambiental (superfícies) | 27 | | **Total** | **406** | : Distribuição dos isolados por origem {.striped} Dos isolados clínicos, **144 não suscetíveis a carbapenêmicos** (CIM de meropenem ≥ 2 µg/mL) foram sequenciados em plataforma Illumina NextSeq 550 (2×150 bp; cobertura >100×), com dados depositados em repositórios públicos (BioProject PRJNA1185159; SRA SRP545647). ### Lacuna de conhecimento ::: {.callout-important} ## Lacuna remanescente Os **27 isolados ambientais** de *K. pneumoniae* coletados de superfícies de alto toque ainda **não foram sequenciados**. A ausência de dados genômicos ambientais impede: 1. Quantificar a proximidade filogenômica entre isolados de pacientes e do ambiente (resolução em nível de SNP) 2. Avaliar compartilhamento de plasmídeos e elementos móveis entre compartimentos 3. Identificar determinantes genômicos associados à adaptação sob protocolos de desinfecção química ::: ### Hipótese central O ambiente de UTI, submetido continuamente a protocolos de desinfecção química (compostos quaternários de amônio/biguanidas), pode **selecionar e/ou manter subpopulações** com maior aptidão ambiental, mediada por: - Genes de tolerância a biocidas (*qac*, *smr*, *emr*) - Sistemas de efluxo - Mecanismos de resposta a estresse - Fatores associados à formação de biofilme --- ## Objetivos ### Objetivo geral Integrar genômica clínica e ambiental para investigar determinantes associados à persistência e transmissão de clones de alto risco de *K. pneumoniae* em UTIs brasileiras sob protocolos de desinfecção química de rotina, produzindo evidências para aprimorar vigilância e controle de infecção no SUS. ### Objetivos específicos 1. **Sequenciar e montar os genomas dos 27 isolados ambientais** de *K. pneumoniae*, aplicando controle de qualidade, montagem e anotação padronizados, com depósito em repositório público. 2. **Reconstruir o relacionamento filogenômico** entre isolados clínicos (n=144) e ambientais (n=27) por análise em nível de SNP (*core genome*), identificando clusters compatíveis com transmissão e persistência. 3. **Comparar resistoma, viruloma e mobiloma** entre compartimentos clínico e ambiental, com ênfase em determinantes de resistência a carbapenêmicos e genes de tolerância a desinfetantes. 4. **Investigar determinantes de persistência** por GWAS bacteriano e modelos estatísticos controlando estrutura populacional. 5. **Gerar evidências aplicáveis** à prática de controle de infecção para CCIHs e vigilância em UTIs. --- ## Metodologia ### Delineamento Estudo observacional analítico baseado em coorte multicêntrica longitudinal com amostragem em três fases (T0/T1/T2) em seis UTIs. O doutorado utilizará: - **Conjunto clínico**: 144 genomas já sequenciados e curados - **Conjunto ambiental**: 27 isolados a serem sequenciados ### Sequenciamento dos isolados ambientais | Etapa | Método/Ferramenta | |-------|-------------------| | Extração de DNA | DNeasy Blood & Tissue (QIAGEN) | | Preparo de bibliotecas | Nextera XT DNA Library Prep (Illumina) | | Sequenciamento | Illumina NextSeq 550, 2×150 bp, >100× | | QC de leituras | FastQC / MultiQC | | Trimagem | Trimmomatic | | Montagem *de novo* | SPAdes | | Avaliação de qualidade | QUAST, CheckM | : Pipeline de sequenciamento e montagem {.striped} ### Análises bioinformáticas | Análise | Ferramentas | |---------|-------------| | Anotação | Prokka | | MLST / cgMLST | Pasteur scheme | | Sorotipagem capsular | Kaptive (K e O loci) | | Filogenômica (SNP) | Snippy → IQ-TREE | | Resistoma | AMRFinderPlus, ResFinder, CARD/RGI | | Viruloma | VFDB | | Tolerância a biocidas | BacMet + busca dirigida (*qac*, *smr*, *emr*, *sugE*) | | Plasmidoma | PlasmidFinder, MOB-suite | | Integrons | IntegronFinder, ISfinder | | GWAS bacteriano | pyseer (modelo de efeitos mistos) | : Ferramentas para análises comparativas {.striped} ### Ensaios fenotípicos complementares Em subconjunto racional de isolados: - **CIM para desinfetantes**: microdiluição em caldo com cloreto de benzalcônio (0,5–512 µg/mL) - **Biofilme**: cristal violeta em microplacas de 96 poços (triplicata, 3 repetições; absorbância 570 nm) - **Estresse oxidativo**: sobrevivência com H₂O₂ 10 mM por 30 min, contagem UFC/mL --- ## Alinhamento estratégico O projeto está alinhado ao **Instituto Paulista de Resistência aos Antimicrobianos (ARIES-UNIFESP)**, CEPID-FAPESP (Processo 2021/10599-3). A caracterização de clones prioritários poderá subsidiar frentes complementares de inovação em controle de infecção, incluindo abordagens de biocontrole baseadas em bacteriófagos. --- ## Estágio BEPE — McMaster University ::: {.callout-note} ## Estágio de 12 meses no exterior **Supervisor**: Prof. Dr. Andrew G. McArthur — diretor do McMaster Infectious Disease Interdepartmental Group e líder do **CARD** (Comprehensive Antibiotic Resistance Database). ::: | Período | Atividades | Entregas | |---------|-----------|----------| | Meses 1–3 | Integração; treinamento CARD/RGI; curadoria de genes de resistência a desinfetantes | Relatório de curadoria | | Meses 4–6 | Sequenciamento *long-read* (~20 isolados); montagem híbrida | Genomas completos; mapa de integrons | | Meses 7–9 | Análises comparativas internacionais; GWAS expandido | Painel preditivo preliminar | | Meses 10–12 | Validação; submissão de dados ao CARD; manuscritos | Manuscrito submetido | : Cronograma de atividades do estágio BEPE {.striped}